現(xiàn)階段驗(yàn)證 RNA 與蛋白結(jié)合的主流實(shí)驗(yàn)有 RIP、RNA pull down、CLIP、FISH-IF 共定位，RIP 和 RNA pull down 應(yīng)用最為廣泛。輝駿生物將詳細(xì)介紹這兩項(xiàng)經(jīng)典互作實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

注意：

* RIP和RNA pull-down這二者是最基礎(chǔ)的RNA-蛋白互作驗(yàn)證；

* CLIP是RIP的升級(jí)版，可獲得精確結(jié)合位點(diǎn)，機(jī)制文章標(biāo)配；

* FISH-IF不直接證明結(jié)合，但提供細(xì)胞空間層面的直觀證據(jù)，常作為輔助佐證實(shí)驗(yàn)；

* 區(qū)分GST pull-down，該實(shí)驗(yàn)多用于蛋白-蛋白體外互作，極少用于RNA-蛋白體系。

如何證明RNA與蛋白分子互作的完整實(shí)驗(yàn)思路？

第一步，篩選候選互作分子，鎖定互作靶點(diǎn)

通過(guò)RIP-seq或者生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等方法，篩選目標(biāo)蛋白結(jié)合的候選RNA，初步鎖定潛在互作分子。

圖1 RIP-seq篩選目標(biāo)蛋白的結(jié)合RNA

或通過(guò)RNA pull down MS篩選出與目標(biāo)RNA結(jié)合的候選蛋白，初步鎖定潛在互作分子。

圖2 RNA pull-down MS篩選目標(biāo)RNA的結(jié)合蛋白

第二步，證明兩個(gè)分子之間存在特異性結(jié)合

RIP實(shí)驗(yàn)是通過(guò)特異性抗體富集細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下的RNA-蛋白復(fù)合物，富集RNA并qPCR定量，可以證明RNA和蛋白在細(xì)胞體內(nèi)存在內(nèi)源性結(jié)合，但無(wú)法區(qū)分是直接結(jié)合還是間接結(jié)合。

圖3 RIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程圖

RNA pull-down是利用生物素標(biāo)記RNA探針調(diào)取結(jié)合蛋白，可以證明RNA與蛋白在體外體系發(fā)生直接結(jié)合。

圖4 RNA pull-down技術(shù)流程圖

注意：體內(nèi)RIP與體外RNA pull down相互佐證，兩套實(shí)驗(yàn)體系同時(shí)具備，結(jié)合結(jié)果一致，互作結(jié)論才可靠、完整。

第三步，證明二者的具體結(jié)合位點(diǎn)

可以通過(guò)構(gòu)建RNA截短突變體、RNA定點(diǎn)序列突變體、蛋白結(jié)構(gòu)域截短突變體，結(jié)合RNA pull down、RIP回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證核心結(jié)合區(qū)域；也可通過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)篩選、特異性序列肽庫(kù)篩選等方法確定特異性結(jié)合位點(diǎn)。

圖5 ACIL不同RNA截短突變體的示意圖

注意：需要同步分析RNA與蛋白結(jié)合后，對(duì)RNA穩(wěn)定性、核質(zhì)定位、翻譯水平以及蛋白表達(dá)、修飾、定位、降解產(chǎn)生的具體影響。

第四步，功能驗(yàn)證

功能驗(yàn)證較為復(fù)雜，要基于具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括正反驗(yàn)證、分子本身表達(dá)驗(yàn)證、下游信號(hào)通路驗(yàn)證，也涉及敲低/過(guò)表達(dá)靶RNA或靶蛋白后，觀察細(xì)胞功能變化以及動(dòng)物疾病表型的改變，明確互作的生物學(xué)功能。

? 過(guò)表達(dá)/敲低目標(biāo)RNA/蛋白，檢測(cè)互作強(qiáng)弱變化；

? 驗(yàn)證下游靶基因、信號(hào)通路表達(dá)改變；

? 細(xì)胞表型（增殖、遷移、侵襲、凋亡）功能實(shí)驗(yàn)；

? 動(dòng)物水平表型驗(yàn)證（高分文章加分項(xiàng)）。

到這里整個(gè)邏輯差不多就完整啦，輝駿生物帶大家來(lái)看看具體的案例解析：

RNA-蛋白互作研究范式：《The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism》以這篇文獻(xiàn)為例。

第一步：篩選找到lnRNA TENM3-AS1的潛在結(jié)合蛋白

這是采用生物素標(biāo)記TENM3-AS1探針開(kāi)展RNA pull-down富集結(jié)合蛋白后（圖C），再通過(guò)質(zhì)譜（MS）鑒定得到的蛋白清單（圖D，由輝駿生物提供質(zhì)譜技術(shù)）。

評(píng)判依據(jù)為蛋白富集度與結(jié)合特異性，富集程度越高，代表該蛋白與TENM3-AS1結(jié)合越穩(wěn)定，越可能是真實(shí)互作蛋白?？梢钥吹剑琱nRNPK的富集水平是所有候選蛋白中最高的，說(shuō)明它和TENM3-AS1的結(jié)合信號(hào)最強(qiáng)，因此被選為核心研究對(duì)象。

第二步：RNA pull-down的Western Blot體外驗(yàn)證

這是質(zhì)譜篩選結(jié)果的初步WB驗(yàn)證：采用生物素標(biāo)記TENM3-AS1開(kāi)展RNA pulldown富集蛋白，陰性對(duì)照用于排除非特異性結(jié)合。WB結(jié)果顯示，TENM3-AS1沉淀復(fù)合物中可檢出hnRNPK特異性條帶，陰性對(duì)照組無(wú)條帶，進(jìn)一步證實(shí)hnRNPK為T(mén)ENM3-AS1的特異性互作蛋白（圖E）。

第三步：RIP-qPCR——體內(nèi)驗(yàn)證佐證二者的結(jié)合

為了進(jìn)一步證實(shí)二者在細(xì)胞內(nèi)源環(huán)境下的結(jié)合，排除抗體非特異性結(jié)合干擾，研究人員在HGC27、BGC823細(xì)胞中進(jìn)行RIP qPCR互作驗(yàn)證。

圖F：IP-hnRNPK，qPCR檢測(cè)TENM3-AS1，IgG 為陰性對(duì)照

利用hnRNPK抗體富集細(xì)胞內(nèi)蛋白-RNA復(fù)合物，IgG作為陰性對(duì)照，通過(guò) qPCR定量檢測(cè)沉淀復(fù)合物中TENM3-AS1的富集水平。結(jié)果顯示，僅hnRNPK抗體沉淀組可顯著富集TENM3-AS1，證明二者在內(nèi)源細(xì)胞生理體系中能夠穩(wěn)定結(jié)合，與體外pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

第四步： 找到TENM3-AS1與hnRNPK互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（RNA層面）

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)合片段，研究人員構(gòu)建了多段TENM3-AS1分段探針：5'端外顯子片段、其余分段RNA片段。

圖G：TENM3-AS1截短體構(gòu)建示意圖、分段探針RNA pull-down驗(yàn)證

分別采用不同TENM3-AS1分段生物素探針富集細(xì)胞蛋白，WB檢測(cè)hnRNPK表達(dá)水平。

結(jié)果明確：只有TENM3-AS1 5' 端外顯子片段可有效捕獲hnRNPK；其余分段 RNA片段均無(wú)明顯結(jié)合信號(hào)。

由此確定：TENM3-AS1的5' 端外顯子片段，是與hnRNPK互作的核心RNA區(qū)域。

第五步：找到hnRNPK與TENM3-AS1互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（蛋白層面）

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)合區(qū)域，研究人員構(gòu)建了多種 hnRNPK 截短突變體，均攜帶 Flag標(biāo)簽，用于結(jié)構(gòu)域互作驗(yàn)證：含KI結(jié)構(gòu)域截短體、缺失KI結(jié)構(gòu)域截短體

圖H：hnRNPK截短體示意圖、截短體RIP驗(yàn)證

將各Flag-hnRNPK截短體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Flag抗體做RIP，qPCR檢測(cè) TENM3-AS1。

結(jié)果明確：只有攜帶KI結(jié)構(gòu)域的hnRNPK截短體，能結(jié)合TENM3-AS1；缺失 KI結(jié)構(gòu)域的截短體，完全無(wú)法與TENM3-AS1結(jié)合。

由此確定：hnRNPK的KI結(jié)構(gòu)域，是與TENM3-AS1互作的關(guān)鍵區(qū)域。

輝駿生物RNA免疫共沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)服務(wù)內(nèi)容

1. RIP qPCR（驗(yàn)證型）服務(wù)內(nèi)容：

Input 樣本誘餌蛋白 WB 質(zhì)控檢測(cè)；設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，富集誘餌蛋白及其結(jié)合 RNA；靶標(biāo) RNA qPCR 定量檢測(cè)

交付結(jié)果：完整 RIP 實(shí)驗(yàn)報(bào)告、蛋白 WB 原圖、qPCR 檢測(cè)原始數(shù)據(jù)

2.  RIP seq（篩選型）服務(wù)內(nèi)容：

Input 樣本誘餌蛋白 WB 質(zhì)控檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組富集結(jié)合 RNA；高通量測(cè)序 + 生物信息分析（實(shí)驗(yàn)組、Input 對(duì)照）

交付結(jié)果：完整 RIP 實(shí)驗(yàn)報(bào)告、蛋白 WB 原圖、測(cè)序原始數(shù)據(jù)、全套生信分析報(bào)告