不少科研人員開(kāi)展轉(zhuǎn)錄調(diào)控課題時(shí)困惑：如何有效驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子 DNA 相結(jié)合？這組互作證據(jù)是完善分子機(jī)制、沖刺高分 SCI 不可或缺的一環(huán)。輝駿生物匯總主流實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為大家系統(tǒng)講解體內(nèi)、體外驗(yàn)證方案。

01 ChIP-qPCR（優(yōu)選，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）

ChIP-qPCR是一種用于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA相互作用的重要技術(shù)。將ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)與qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）檢測(cè)相結(jié)合，可以精準(zhǔn)定量特定蛋白質(zhì)與目標(biāo)基因位點(diǎn)的結(jié)合水平。ChIP技術(shù)利用抗體特異性富集結(jié)合特定轉(zhuǎn)錄因子（TF）/組蛋白修飾結(jié)合的DNA片段；qPCR技術(shù)以SYBR熒光染料為檢測(cè)基礎(chǔ)，染料可非特異性嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生熒光信號(hào)，使熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量完全同步，最終通過(guò)Ct值（循環(huán)閾值）完成定量檢測(cè)，可以計(jì)算出結(jié)合蛋白的富集水平。

ChIP-qPCR能夠?qū)Ｒ?，靈敏，快速，高重復(fù)地定量生物樣品中特定轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白修飾與已知基因啟動(dòng)子的結(jié)合。ChIP-qPCR因其體內(nèi)富集（相比體外實(shí)驗(yàn)）能夠更真實(shí)地反映結(jié)合狀態(tài)的特性，被眾多老師青睞，也是文章首選驗(yàn)證方式。

• 實(shí)驗(yàn)流程：

圖1 ChIP實(shí)驗(yàn)流程示意圖-輝駿生物ChIP實(shí)驗(yàn)服務(wù)

02 雙熒光素酶報(bào)告基因（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）

雙螢光素酶報(bào)告基因（Dual-Luciferase）檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒(méi)有交叉干擾。以Luciferase為核心，構(gòu)建待測(cè)啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒與攜帶海腎熒光素酶基因的內(nèi)參質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解細(xì)胞，分別加熒光素酶底物，用熒光測(cè)定儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，通過(guò)數(shù)據(jù)得出基因表達(dá)量，從而確定構(gòu)建序列的功能（正調(diào)控或負(fù)調(diào)控）。

雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。該技術(shù)通常需要與其他技術(shù)配合驗(yàn)證。

• 實(shí)驗(yàn)流程：

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)流程示意圖-輝駿生物

03 DNA pull-down WB（體外實(shí)驗(yàn)）

DNA pull-down WB是一種用于研究體外DNA和蛋白質(zhì)相互作用的重要技術(shù)。將DNA pull-down（DNA下拉富集）實(shí)驗(yàn)與WB（蛋白質(zhì)免疫印跡）檢測(cè)相結(jié)合，可以精準(zhǔn)驗(yàn)證特定DNA序列與特定靶蛋白的結(jié)合。DNA pull-down技術(shù)利用生物素標(biāo)記探針，特異性富集與目標(biāo)DNA結(jié)合的蛋白片段；WB技術(shù)以抗原抗體特異性結(jié)合為檢測(cè)基礎(chǔ)，特異性識(shí)別靶蛋白，激發(fā)顯色發(fā)光信號(hào)，保證信號(hào)強(qiáng)度的變化與樣品中靶蛋白含量的變化完全同步，最后利用條帶灰度值進(jìn)行定性半定量分析，可以檢測(cè)出目標(biāo)DNA與靶蛋白的結(jié)合水平。

DNA pull-down WB能夠?qū)Ｒ?、靈敏、直觀、穩(wěn)定地驗(yàn)證樣本中目標(biāo)DNA與下游結(jié)合蛋白的體外互作關(guān)系。DNA pulldown WB因其體外靶向篩選（相比體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）能夠明確DNA與蛋白直接結(jié)合關(guān)系的特性，被廣泛應(yīng)用于分子互作機(jī)制研究，也是文章驗(yàn)證體外互作的經(jīng)典方式。

• 實(shí)驗(yàn)流程：

圖3 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)流程示意圖-輝駿生物

以上3種技術(shù)是目前文章中比較常用的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子互作驗(yàn)證的技術(shù)手段（輝駿生物可提供ChIP-qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因、DNA pull-down WB實(shí)驗(yàn)服務(wù)），一般來(lái)說(shuō)文章會(huì)選擇2種及以上技術(shù)手段進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)考慮兼顧體內(nèi)驗(yàn)證和體外驗(yàn)證，在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽攸c(diǎn)選擇合適的方法。

客戶研究案例一：

• 發(fā)表日期：2025年5月

• 發(fā)表期刊：Advanced science

• 影響因子：14.1

• 實(shí)驗(yàn)方法：ChIP-seq、ChIP-qPCR、JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等

• 結(jié)果解讀：驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子STAT1與MAP3K8啟動(dòng)子互作

圖4 轉(zhuǎn)錄因子STAT1與MAP3K8啟動(dòng)子互作驗(yàn)證示意圖

客戶研究案例二：

• 發(fā)表日期：2025年6月

• 發(fā)表期刊：Molecular cancer

• 影響因子：33.9

• 實(shí)驗(yàn)方法：ChIP seq、motif分析、ChIP qPCR、JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等

• 結(jié)果解讀：驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子EGR1與啟動(dòng)子TENM3-AS1互作

圖5 轉(zhuǎn)錄因子EGR1與啟動(dòng)子TENM3-AS1互作驗(yàn)證示意圖

客戶研究案例三：

• 發(fā)表日期：2018年9月

• 發(fā)表期刊：Journal of hematology & oncology

• 影響因子：40.4

• 實(shí)驗(yàn)方法：DNA pulldown MS、DNA pulldown WB、ChIP qPCR等

• 結(jié)果解讀：驗(yàn)證XRCC5蛋白與CLC-3啟動(dòng)子的相互作用

圖6 XRCC5蛋白與CLC-3啟動(dòng)子互作驗(yàn)證示意圖

輝駿生物把研究啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中常用的幾種方法匯總?cè)缦拢?/span>

參考文獻(xiàn)

[1] Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

[2] Tang Y, Zhao B, Wang W, et al. The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism. Mol Cancer 24(1):165(2025).

[3] Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

DNA pull down * 服務(wù)信息

染色質(zhì)免疫共沉淀chip實(shí)驗(yàn)服務(wù)信息

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) * 服務(wù)信息