蛋白互作驗(yàn)證是分子機(jī)制、信號(hào)通路研究及SCI論文的核心內(nèi)容，Co?IP免疫共沉淀是體內(nèi)驗(yàn)證蛋白互作的主流技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段，很多科研人員常有以下困惑： 

1. 該用定性Co?IP驗(yàn)證互作，還是定量Co?IP分析互作？

2. 兩種實(shí)驗(yàn)操作相近，核心區(qū)別是什么？ 

3. 選錯(cuò)實(shí)驗(yàn)為何會(huì)數(shù)據(jù)失效、重復(fù)性差？ 

4. 哪些情形會(huì)被審稿人質(zhì)疑，耽誤課題進(jìn)度？ 

輝駿生物結(jié)合多篇SCI文獻(xiàn)，解析定性、定量Co?IP的原理、實(shí)操要點(diǎn)、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景，為蛋白互作實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考。

定性還是定量Co-IP，如何選擇?

定性Co-IP的應(yīng)用
定性Co-IP主要判斷蛋白A與蛋白B是否存在互作，不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)互作強(qiáng)弱，也不能直接證明二者為直接結(jié)合。只檢測(cè)蛋白和蛋白之間有無(wú)相互結(jié)合。

定量Co-IP的應(yīng)用

定量Co-IP主要通過(guò)藥物刺激、基因調(diào)控或引入靶蛋白C等外界條件處理，比較蛋白A與蛋白B相互結(jié)合程度的變化，判斷二者互作是增強(qiáng)還是減弱。

可用于分析不同處理?xiàng)l件對(duì)蛋白互作影響，但不能直接證明二者為直接結(jié)合。主要檢測(cè)蛋白與蛋白之間互作程度變化。

定性Co-IP操作要點(diǎn)和案例分析

1、內(nèi)源定性Co-IP

細(xì)胞或者組織內(nèi)，自然存在的A和B靶蛋白的相互結(jié)合。

（1）操作要點(diǎn)

不做任何處理，用野生型的細(xì)胞或者組織直接做。

（2）案例解讀

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組用誘餌蛋白抗體（這里是CXCR3抗體)，對(duì)照組用同種屬的正常IgG。

圖1 Co-IP檢測(cè)CXCR3與Beclin1互作

2、外源定性Co-IP

通過(guò)轉(zhuǎn)染A質(zhì)粒，檢測(cè)外來(lái)的A與胞內(nèi)存在或者外源表達(dá)的B蛋白的相互結(jié)合。

（1）操作要點(diǎn)

一般采用工具細(xì)胞檢測(cè)，例如HEK293T、HeLa細(xì)胞等，構(gòu)建帶有標(biāo)簽（例如Flag、HA、V5等）的目的質(zhì)粒，IP富集標(biāo)簽融合蛋白。

（2）應(yīng)用案例

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)帶標(biāo)簽的誘餌蛋白，對(duì)照組轉(zhuǎn)標(biāo)簽空載體，用相應(yīng)的標(biāo)簽抗體磁珠做IP（這里用的是HA標(biāo)簽）。

圖2 Co-IP檢測(cè)Pit1-HA與Pit2-Myc、RGA4-Myc互作

定量Co-IP操作要點(diǎn)和案例分析

分為簡(jiǎn)單定量實(shí)驗(yàn)和復(fù)雜定量實(shí)驗(yàn)（復(fù)雜的就是引入多個(gè)變量，去檢測(cè)蛋白a與蛋白b的互作程度，文獻(xiàn)中常見(jiàn)的基本都?xì)w為簡(jiǎn)單定量實(shí)驗(yàn)）。

定量Co-IP的重點(diǎn)是要保證各組別的初始樣本量完全一致、處理?xiàng)l件和IP過(guò)程嚴(yán)格同步。

1、內(nèi)源定量Co-IP

細(xì)胞或者組織蛋白樣本內(nèi)，加藥或引入靶蛋白c，檢測(cè)A蛋白與B蛋白互作是增強(qiáng)還是減弱。

（1）操作要點(diǎn)

加藥處理，用野生型的細(xì)胞或者組織直接做。這里是加了Pep9。

（2）應(yīng)用案例

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：加不同濃度的Pep9處理，檢測(cè)Pep9對(duì)NLRP6與p85α結(jié)合影響；

Input需孵育內(nèi)參，來(lái)保證初始樣本量一致。

圖3 Co-IP檢測(cè)Pep9對(duì)NLRP6與p85α互作影響

2、外源定量Co-IP
通過(guò)轉(zhuǎn)染A，B和C質(zhì)粒，檢測(cè)C蛋白是否影響了A與B蛋白的互作。

（1）操作要點(diǎn)

引入靶蛋白C來(lái)檢測(cè)比較蛋白A與蛋白B相互結(jié)合程度的變化。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)免疫共沉淀Co-IP（標(biāo)簽蛋白）：實(shí)驗(yàn)原理+詳細(xì)步驟。

（2）應(yīng)用案例

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：前四組充當(dāng)陰性對(duì)照組，后兩組為實(shí)驗(yàn)組；

?共轉(zhuǎn)HA-ASK1和His-TRAF6，檢測(cè)未處理時(shí)的互作強(qiáng)度；

?共轉(zhuǎn)HA-ASK1、His-TRAF6和Flag-MVP，檢測(cè)Flag-MVP對(duì)HA-ASK1與His-TRAF6的互作影響。

圖4 Co-IP檢測(cè)Flag-MVP對(duì)HA-ASK1與His-TRAF6互作影響

輝駿生物可承接定性 Co?IP、定量 Co?IP 全流程技術(shù)服務(wù)：

① 定性 Co?IP 服務(wù)：

專注驗(yàn)證蛋白之間是否存在體內(nèi)互作，包含內(nèi)源 Co?IP、Flag/HA/GFP 標(biāo)簽外源 Co?IP，配套 Co?IP?WB 二元互作驗(yàn)證、Co?IP?MS 未知互作蛋白篩選，完成蛋白提取、免疫沉淀富集、WB 檢測(cè)、質(zhì)譜鑒定，輸出完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告與原始圖片數(shù)據(jù)，支持截短體互作區(qū)段定位，滿足基礎(chǔ)互作驗(yàn)證、互作蛋白篩選等課題需求。

② 定量 Co?IP 服務(wù)：

用于對(duì)比不同處理、不同基因干預(yù)條件下蛋白互作強(qiáng)弱變化，提供梯度處理樣本 IP、SILAC 定量 IP?MS 服務(wù)，完成互作蛋白定量分析，配套 GO、KEGG 等生信解析，可直觀體現(xiàn)互作增強(qiáng)或減弱，適配機(jī)制研究、藥物調(diào)控互作等深度機(jī)制課題，同時(shí)支持內(nèi)源、標(biāo)簽體系及各類個(gè)性化對(duì)照方案設(shè)計(jì)。

輝駿生物依托自有蛋白及質(zhì)譜平臺(tái)，從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、樣本處理、免疫富集到數(shù)據(jù)交付全程落地，提供一對(duì)一技術(shù)對(duì)接，數(shù)據(jù)可直接用于 SCI 論文投稿。