轉(zhuǎn)錄因子（TF）與順式作用元件的互作，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心，廣泛應(yīng)用于腫瘤表觀遺傳、分子機制等研究領(lǐng)域，也是高分機制論文的研究重點。

對于SCI發(fā)表而言，單純表型數(shù)據(jù)難以突破二區(qū)瓶頸，驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的互作關(guān)系，是沖刺一區(qū)及頂級子刊的核心條件。該研究分為兩種模式：已知TF篩選下游啟動子、已知啟動子挖掘上游調(diào)控TF。

業(yè)內(nèi)普遍結(jié)合三項實驗構(gòu)建完整驗證體系：ChIP驗證細胞內(nèi)天然環(huán)境下蛋白與DNA的內(nèi)源結(jié)合；DNA pull down驗證體外直接物理互作；雙熒光素酶實驗檢測轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活/抑制功能。

輝駿生物結(jié)合多年項目經(jīng)驗，深度解析三項實驗的操作難點與避坑要點，助力科研人員快速完成TF-DNA互作機制研究。如需相關(guān)技術(shù)咨詢、實驗外包及產(chǎn)品訂購，可隨時聯(lián)系：4006991663！

轉(zhuǎn)錄因子與啟動子DNA互作驗證方法

1、DNA pulldown實驗

DNA pull down是研究目標DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。通過在體外條件下制備生物素標記的目標DNA探針，來調(diào)取樣本中與之結(jié)合的蛋白質(zhì)，可以用來篩選未知結(jié)合蛋白，或驗證預(yù)測的已知蛋白。

圖1 DNA pull-down實驗原理圖-輝駿生物

2、ChIP實驗

ChIP是研究目標蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。利用誘餌蛋白抗體來調(diào)取生物體內(nèi)天然結(jié)合的誘餌蛋白及其結(jié)合DNA片段的復(fù)合體，進而通過測序?qū)ふ椅粗慕Y(jié)合DNA序列，或通過qPCR驗證預(yù)測的已知DNA序列。

圖2 ChIP實驗原理圖-輝駿生物

DNA pull down是體外驗證目標DNA與預(yù)測蛋白間的結(jié)合，ChIP是體內(nèi)驗證目標蛋白與預(yù)測DNA間的結(jié)合。區(qū)別如下：

3、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br style="margin: 0px; padding: 0px;"/>

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是研究啟動子轉(zhuǎn)錄活性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的常用技術(shù)，基于螢火蟲與海腎兩種熒光素酶的發(fā)光原理，以對應(yīng)熒光素為底物催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物熒光，通過報告基因+內(nèi)參基因雙體系校正實驗誤差、精準反映基因表達水平與啟動子活性。用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的驗證與研究。

圖3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘韴D-輝駿生物

轉(zhuǎn)錄因子與啟動子DNA互作思路及應(yīng)用案例

1、已知轉(zhuǎn)錄因子，尋找未知的啟動子DNA研究思路

（1）先利用ChIP-seq等技術(shù)大規(guī)模篩選目標轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列；

（2）通過功能分析確定這些基因與課題研究的相關(guān)性，篩選出幾個待驗證的靶基因；

（3）采用ChIP-qPCR等技術(shù)驗證二者的結(jié)合關(guān)系;

（4）進一步明確結(jié)合的功能性，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_認轉(zhuǎn)錄因子對DNA啟動子活性的調(diào)控作用，完善互作的功能意義。

文獻應(yīng)用案例解析-輝駿生物

該研究篩選并鑒定出MAP3K8啟動子的核心候選轉(zhuǎn)錄因子STAT1，逐步驗證了STAT1與MAP3K8啟動子的特異性結(jié)合關(guān)系，明確二者的互作調(diào)控關(guān)聯(lián)。

（1）ChIP-seq與MAPK通路相關(guān)基因重疊分析

通過ChIP-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)合MAPK通路相關(guān)基因重疊篩選，鑒定出IL1A、MAP3K8、BDNF、MET共4個核心候選介導(dǎo)基因，明確其可介導(dǎo)STAT1與p38-MAPK通路的關(guān)聯(lián)調(diào)控關(guān)系（圖4a）。

（2）驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用

ChIP-qPCR證實轉(zhuǎn)錄因子STAT1與MAP3K8啟動子存在相互作用（圖4b）。

（3）雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灦ㄎ唤Y(jié)合區(qū)域

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，包含TSS上游-450 bp至TSS序列的質(zhì)粒，不影響STAT1過表達誘導(dǎo)的熒光素酶活性；而包含TSS上游-500 bp及更長序列至TSS的質(zhì)粒，可顯著增強STAT1過表達誘導(dǎo)的熒光素酶活性。結(jié)果表明，MAP3K8啟動子上STAT1的結(jié)合區(qū)域位于TSS上游-2000 ~ -450 bp區(qū)間內(nèi)（圖4c）。

（4）JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合位點

利用JASPAR數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測出MAP3K8啟動子上轉(zhuǎn)錄因子STAT1的特異性結(jié)合位點（圖4d）。

（5）位點突變驗證

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實STAT1結(jié)合位點突變后，STAT1過表達誘導(dǎo)的熒光素酶活性顯著降低（圖4e）。

圖4 引自Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

2、已知啟動子DNA，尋找未知的轉(zhuǎn)錄因子的研究思路

第一步，通過DNA pull-down MS實驗和/或數(shù)據(jù)庫檢索分析，篩選出可能與目標啟動子DNA結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄因子，完成“篩選”環(huán)節(jié)；

第二步，通過Jaspar等數(shù)據(jù)庫預(yù)測目標啟動子與待測轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點；

第三步，采用ChIP qPCR或DNA pull-down WB實驗，捕獲轉(zhuǎn)錄因子與目標DNA的復(fù)合物，排除非特異性結(jié)合蛋白，落實“驗證”環(huán)節(jié)；

第四步，明確轉(zhuǎn)錄因子對目標DNA的特異性結(jié)合和調(diào)控作用，完成“功能確證”環(huán)節(jié)，形成完整的DNA-轉(zhuǎn)錄因子互作研究閉環(huán)。

文獻應(yīng)用案例1

該研究篩選并鑒定出PD-L1啟動子的核心候選轉(zhuǎn)錄因子EED，逐步驗證EED與PD-L1啟動子的相互作用關(guān)系，明確二者的互作調(diào)控關(guān)聯(lián)。

（1）DNA pull-down MS和數(shù)據(jù)分析篩選啟動子結(jié)合的潛在轉(zhuǎn)錄因子

通過DNA pull-down MS（由輝駿生物提供技術(shù)服務(wù)）實驗分析篩選鑒定出34個PD-L1啟動子的潛在結(jié)合差異蛋白（DEPs），結(jié)合hTF-target數(shù)據(jù)庫開展交叉驗證分析，最終確定轉(zhuǎn)錄因子EED為核心候選因子開展后續(xù)機制研究（圖5a）。

（2）轉(zhuǎn)錄因子EED的功能驗證

WB、qRT-PCR、免疫熒光實驗證實CXCL1可顯著誘導(dǎo)EED表達與核轉(zhuǎn)運，有效提升PD-L1啟動子活性、促進PD-L1蛋白表達（圖5b-d）；而敲低EED表達可部分逆轉(zhuǎn)并消除CXCL1對PD-L1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達的誘導(dǎo)調(diào)控作用（圖5c、d）。

（3）JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)合位點

利用JASPAR數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測出PD-L1啟動子區(qū)域存在EED的特異性潛在結(jié)合位點（5'-GTTCCACTC-3'，?437 ~ ?429bp）（圖5e）。

（4）驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用

ChIP-qPCR實驗證實轉(zhuǎn)錄因子EED與PD-L1啟動子存在特異性相互作用；同時驗證CXCL1可顯著增強EED與PD-L1啟動子的結(jié)合能力，而敲低EED可有效削弱并部分消除二者的結(jié)合互作關(guān)系（圖5e）。

（5）位點突變結(jié)合功能驗證

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>證實PD-L1啟動子上EED的結(jié)合位點進行反義突變后，可顯著阻斷并消除CXCL1對PD-L1啟動子活性的誘導(dǎo)激活作用（圖5f）。

圖5 引自[輝駿生物客戶文章] Wang S, Li J, Hong S, et al. Chemotherapy-elicited extracellular vesicle CXCL1 from dying cells promotes triple-negative breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling. J Exp Clin Cancer Res 43(1):121(2024).

文獻應(yīng)用案例2

該研究篩選并鑒定出可結(jié)合CLC-3啟動子的核心候選蛋白XRCC5，逐步驗證了XRCC5與CLC-3啟動子的特異性結(jié)合關(guān)系，明確二者的互作調(diào)控關(guān)聯(lián)。

（1）DNA pull-down MS鑒定篩選CLC-3啟動子結(jié)合候選靶蛋白

通過質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)）分析篩選確定XRCC5為CLC-3啟動子的候選結(jié)合靶蛋白（圖6a、6b）。

（2）驗證蛋白與啟動子的結(jié)合作用

DNA pull-down WB實驗證實XRCC5能夠與CLC-3啟動子發(fā)生特異性結(jié)合，明確了XRCC5與CLC-3啟動子的相互作用關(guān)系（圖6c）。

（3）進一步驗證XRCC5與CLC-3啟動子的相互作用

ChIP實驗進一步在證實XRCC5與CLC-3 DNA在各類細胞中均存在相互作用，且正常細胞中二者的結(jié)合量最低（圖6d）。

圖6 引自Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

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