在RNA-蛋白（RNP）互作研究中，僅篩選獲得潛在目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白（RBP）并非研究終點(diǎn)，其僅為后續(xù)機(jī)制研究的基礎(chǔ)鋪墊。精準(zhǔn)篩選并鑒定目標(biāo)RBP特異性結(jié)合的靶標(biāo)RNA，是解析RBP轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制、提升科研論文學(xué)術(shù)價(jià)值與創(chuàng)新性的核心環(huán)節(jié)，直接決定課題研究方向的準(zhǔn)確性與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性。

目前，目標(biāo)蛋白結(jié)合RNA的主流研究范式為：通過(guò)文獻(xiàn)挖掘及RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）等高通量技術(shù)，篩選獲得目標(biāo)RBP的潛在結(jié)合候選RNA，再利用RNA免疫沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RIP-qPCR）技術(shù)驗(yàn)證二者結(jié)合的特異性，最終鎖定目標(biāo)靶標(biāo)RNA。

本文結(jié)合SCI經(jīng)典文獻(xiàn)與輝駿生物專(zhuān)屬技術(shù)方案，系統(tǒng)詳解目標(biāo)蛋白結(jié)合RNA的鑒定與驗(yàn)證流程，精準(zhǔn)拆解實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)、結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及核心數(shù)據(jù)解讀要點(diǎn)，助力科研工作者高效推進(jìn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。輝駿生物旗下優(yōu)質(zhì)RIP試劑盒、RNA pull-down試劑盒及一站式技術(shù)服務(wù)，助力無(wú)數(shù)科研人突破瓶頸并發(fā)表高分SCI，如有RNA-蛋白互作相關(guān)技術(shù)疑問(wèn)或產(chǎn)品訂購(gòu)需求，歡迎隨時(shí)咨詢(xún)。

 目標(biāo)蛋白結(jié)合RNA應(yīng)用案例 

案例1：ZmBFF1蛋白結(jié)合的RNA是U1 snRNA

（1）RIP-seq測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)ZmMBF1蛋白與U1 snRNA顯著富集（圖1A）。

（2）RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZmMBF1-HA蛋白與U1 snRNA存在直接相互作用（圖 1B，由輝駿生物提供RIP試劑盒）。

（3）BiFC（雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)）及LCI（熒光素酶互補(bǔ)成像）蛋白-蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ZmMBF1蛋白在植物細(xì)胞中與U1-70K蛋白存在相互作用（圖1C、1D）。

圖1 引自[輝駿生物客戶(hù)文章] Hao S, Han S, He Z, et al. Genomic basis underlying alternative transcripts-mediated drought tolerance in maize. Genome Biol 27(1):47(2026). 

案例2：ACAT1蛋白、PSMD14蛋白結(jié)合的RNA是circUBR5

（1）RNA pull-down MS篩選發(fā)現(xiàn)生物素標(biāo)記的circUBR5顯著富集ACAT1蛋白、PSMD14（圖2A、2B）。

（2）RPISeq預(yù)測(cè)circUBR5與ACAT1存在高概率相互作用（隨機(jī)森林得分=0.8，圖2C）。

（3）RNAfold與3dRNA分別預(yù)測(cè)circUBR5二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中ACAT1結(jié)構(gòu)，經(jīng)HDOCK分子對(duì)接明確二者相互作用界面（圖2D）。

（4）RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACAT1蛋白與circUBR5存在特異性結(jié)合（圖2E，由輝駿生物提供RIP試劑盒）。

（5）RNA pull-down MS分析發(fā)現(xiàn)circUBR5結(jié)合伙伴中存在去泛素化酶PSMD14蛋白（圖2B）。

（6）RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)PSMD14蛋白與circUBR5存在直接結(jié)合（圖2F，由輝駿生物提供RIP試劑盒）。

圖2 引自[輝駿生物客戶(hù)文章] Jiang Y, Zhao Z, Ma L, et al. Exosomal circUBR5 drives metastasis and chemoresistance in gastric signet-ring cell carcinoma by reprogramming cholesterol metabolism through the hsa-miR-1208/CYP19A1 axis and ACAT1 upregulation. Cancer Lett 641:218279(2026).

案例3：NACA蛋白特異性結(jié)合的RNA是lnc-GD2H

（1）RNA pull-down MS分析鑒定出生物素標(biāo)記的lnc-GD2H的潛在RNA結(jié)合蛋白是NACA（圖3A-3C）。

（2）RPISeq數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，lnc-GD2H與NACA蛋白存在高概率相互作用（RF和SVM分類(lèi)器值>0.5，概率>0.5被認(rèn)為是“正”，圖3D）。

（3）RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)NACA蛋白可特異性結(jié)合lnc-GD2H（圖3E，由輝駿生物提供RIP試劑盒）。

圖3 引自[輝駿生物客戶(hù)文章] Chen R, Lei S, She Y, et al. Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol 9:671857(2021). 

RIP技術(shù)流程

（1）細(xì)胞裂解：釋放RBP-RNA復(fù)合物。

（2）Input制備：取30 μL作為蛋白 input，取30 μL作為RNA input。

圖4 RIP實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)圖-輝駿生物

（3）RIP：抗體結(jié)合目標(biāo)RBP，磁珠捕獲復(fù)合物。

（4）洗滌：去除未結(jié)合RNA片段。

（5）洗脫：得到“蛋白-RNA互作復(fù)合體”。

（6）RNA提取純化：試劑盒或者Trizol提取RNA。

（7）RNA分析：提取后的RNA、RNA input可用于qPCR實(shí)驗(yàn)或高通量測(cè)序。

圖5 RIP技術(shù)流程圖-輝駿生物

 RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀 

RIP結(jié)果解讀1

作者為分析METTL14蛋白與RNA的結(jié)合特性，利用RIP-qPCR進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)誘餌蛋白METTL14分離METTL14-RNA復(fù)合物，成功獲得目標(biāo)復(fù)合物（圖A）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在METTL14組中，AQP3相對(duì)于IgG組的富集度約為83.6倍，表明AQP3可與METTL14特異性結(jié)合（圖B）。

圖6 引自[輝駿生物客戶(hù)文章] Nong Y, Zhai Q, Liu W, et al. AQP3 Influences Unexplained Recurrent Abortion by Regulating Trophoblast Cell Migration and Invasion via the METTL14/IGF2BP1/AQP3/PI3K/AKT Pathway. J Cell Mol Med 29(3):e70325(2025). 

RIP結(jié)果解讀2

作者為探究LTA4H對(duì)HNRNPA1蛋白與RNA結(jié)合特性的調(diào)控作用，采用RIP-qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以HNRNPA1為靶蛋白富集HNRNPA1-RNA復(fù)合物。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，LTA4H過(guò)表達(dá)組中Ltbp1 mRNA 的富集程度顯著降低，表明 LTA4H過(guò)表達(dá)可減弱HNRNPA1與Ltbp1 mRNA 的相互作用（圖H）。

圖7 引自[輝駿生物客戶(hù)文章] Yang S, Qiu X, Yang Y, et al. LTA4H improves the tumor microenvironment and prevents HCC progression via targeting the HNRNPA1/LTBP1/TGF-β axis. Cell Rep Med 6(3):102000(2025).

 RIP實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題 

Q1：想做miRNA-RNA互作驗(yàn)證，可以如何設(shè)計(jì)RIP實(shí)驗(yàn)？

如果想驗(yàn)證ceRNA機(jī)制，可以用anti-Ago2抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。

① 先在正常條件下進(jìn)行RIP，驗(yàn)證Ago 2可結(jié)合目標(biāo)RNA和miRNA，暗示目標(biāo)miRNA和RNA與ceRNA機(jī)制有關(guān)；

② 然后過(guò)表達(dá)/抑制miRNA或靶mRNA，再進(jìn)行anti-Ago2 RIP，檢測(cè)RIP產(chǎn)物中富集的目標(biāo)miRNA和RNA量是否隨之變化。

③ 通過(guò)RNA pulldown（標(biāo)簽法）和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-RNA的互作。

Q2：RIP抗體選擇有什么要求？為什么要求IP和IgG抗體種屬一致？

需選擇IP級(jí)抗體，建議IP抗體和IgG抗體選擇相同種屬，如IP抗體是兔源，IgG也應(yīng)選擇兔源。IgG組是陰性對(duì)照也是同型對(duì)照，需與IP抗體同種屬來(lái)源、同劑量、同亞型，以消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景信號(hào)。

Q3：WB分析RIP的蛋白產(chǎn)物，為什么Input、IP和IgG都有條帶，且位置在約25 kd或者55 kd？

可能存在IP抗體的輕重鏈干擾；解決方法：①WB檢測(cè)時(shí)使用HRP 直接標(biāo)記的一抗；②選用僅識(shí)別天然構(gòu)象抗體的二抗進(jìn)行 WB；③WB采用特異性識(shí)別抗體輕鏈或重鏈的二抗；④內(nèi)源Co-IP實(shí)驗(yàn)可直接選用IP專(zhuān)用二抗；⑤標(biāo)簽Co-IP使用標(biāo)簽納米抗體磁珠（Flag，HA，V5，GFP，RFP可選）等進(jìn)行IP。

需要IP專(zhuān)用二抗、標(biāo)簽納米抗體磁珠的同學(xué)們可以聯(lián)系輝駿生物~

Q4：RIP-qPCR出不來(lái)結(jié)果或CT值都接近40，怎么辦？

①檢查樣本中目標(biāo)蛋白和RNA的內(nèi)源性表達(dá)量，若表達(dá)量較低，建議考慮過(guò)表達(dá)后再做RIP；

② 檢查抗體是否IP級(jí)抗體及其特異性和活性；

③ 如果樣本降解，建議重新準(zhǔn)備樣本和RIP實(shí)驗(yàn)，注意低溫操作；

④ 可嘗試加大起始細(xì)胞量，如加大到2×10*7或3×10*7細(xì)胞。

Q5：RIP-qPCR結(jié)果IP和IgG組相差不大，是什么原因呢？

① IP抗體失效：先WB驗(yàn)證RIP蛋白產(chǎn)物，確認(rèn)IP組正常下拉目的蛋白，可正常富集蛋白結(jié)合的RNA；確認(rèn)IgG組無(wú)下拉目的蛋白，不能富集蛋白結(jié)合的RNA。否則可能是抗體的問(wèn)題，建議確認(rèn)IP級(jí)抗體的特異性和活性。

②非特異性結(jié)合：若IP和IgG組均富集了相當(dāng)量的目的RNA，可能存在非特異性結(jié)合，建議洗滌步驟采用較強(qiáng)的Buffer C，減少孵育時(shí)間，增加洗滌次數(shù)。

③ 在某些條件下目的蛋白與RNA不結(jié)合。

 輝駿生物RIP實(shí)驗(yàn)服務(wù)優(yōu)勢(shì) 

輝駿生物在RNA-蛋白（RNP）、蛋白-蛋白（PPI）、DNA-蛋白（DPI）互作研究領(lǐng)域已深耕十五余年，聚焦科研課題核心需求，為各類(lèi)互作相關(guān)研究提供全流程技術(shù)解決方案，覆蓋課題開(kāi)展全周期，助力科研工作者高效突破實(shí)驗(yàn)瓶頸。

依托自有標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)，輝駿生物可高效完成RNA免疫沉淀（RIP）產(chǎn)物的高通量測(cè)序，同時(shí)提供深度生物信息學(xué)分析服務(wù)，精準(zhǔn)解析測(cè)序數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義，為實(shí)驗(yàn)結(jié)論提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

此外，其可提供從課題實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)施，到數(shù)據(jù)整理、論文撰寫(xiě)及修改發(fā)表的全鏈條技術(shù)支持，目前已助力客戶(hù)將研究成果發(fā)表于上百篇國(guó)際高水平期刊，是互作研究領(lǐng)域極具公信力的科研合作伙伴。

 輝駿生物RIP試劑盒 

以上是本期核心內(nèi)容，輝駿生物深耕蛋白互作領(lǐng)域十余載，供應(yīng)Flag/HA/V5/GFP/RFP等納米抗體磁珠、IP專(zhuān)用二抗、各類(lèi)標(biāo)簽抗體、內(nèi)參抗體及蛋白互作試劑盒，提供RIP、Co-IP等互作實(shí)驗(yàn)及蛋白檢測(cè)服務(wù)，相關(guān)技術(shù)咨詢(xún)與產(chǎn)品訂購(gòu)可隨時(shí)溝通。

 輝駿生物簡(jiǎn)介 

廣州輝駿生物科技股份有限公司（Fitgene）成立于2011年，超15年科研服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，專(zhuān)業(yè)提供蛋白（抗體）和互作實(shí)驗(yàn)服務(wù)，包括蛋白質(zhì)譜檢測(cè)、蛋白/RNA/DNA/化合物等分子間相互作用檢測(cè)、抗體穩(wěn)定表達(dá)株構(gòu)建、基因敲除和過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建等；同時(shí)還研發(fā)了納米抗體磁珠、IP專(zhuān)用二抗、互作試劑盒、標(biāo)簽抗體等科研產(chǎn)品。

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目前，客戶(hù)已在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology（IF: 40.4)、European Heart Journal （IF: 35.7）、Molecular Cancer（IF: 33.9）、Cell Discovery （IF: 33.5）、Nature Methods（IF: 32.1）等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章。